I presupposti scientifici di questa ricerca, si basano su numerosi rilievi clinici e sperimentali che hanno documentato ampiamente il ruolo svolto dalle interazioni stroma epitelio nella citodifferenziazione, nella organogenesi e nello sviluppo della prostata durante la vita fetale e prepubere e nel mantenimento della normale funzionalità prostatica nell’individuo adulto [1-9]. Nel 1986 Tenniswood [10] per spiegare questi fenomeni, ha ipotizzato un meccanismo di regolazione basato su tre segnali induttivi, uno di origine stromale stimolante la crescita epiteliale (Stromally Derived Growth Factor o SDGF) e due di origine epiteliale rispettivamente ad azione inducente (Epithelially Derived Growth Factor o EDGF) ed inibente la crescita stromale (Epithelially Derived Inhibiting Factor o EDIF). In base a tale teoria, il controllo della crescita e la regolazione della funzionalità prostatica dipenderebbero dal bilanciamento degli stimoli induttivi. Attualmente questa teoria è suffragata da un considerevole numero di evidenze sperimentali che attestano l’esistenza nel tessuto prostatico di meccanismi di regolazione paracrini ed autocrini riferibili sia a fattori di crescita che a fattori inibenti la proliferazione [11, 12]. È stato dimostrato, infatti, che almeno cinque differenti famiglie di Growth Factor (Insulin-like Growth Factor (IGF) family, Plateled Derived Growth Factor (PDGF) family, Epidermal Growth Factor (EGF) family, Transforming Growth Factor-beta (TGF-b) family, Heparin Binding (fibroblastic) Growth Factor (HBGF/FGF) family) modulano la crescita e la differenziazione delle cellule prostatiche normali, ipertrofiche e neoplastiche [13]. È, inoltre, possibile che i segnali tra i differenti tipi di cellule all’interno della prostata siano trasmessi attraverso il coinvolgimento della matrice extra-cellulare [14]. Anomalie ed aberrazioni dei processi induttivi tra stroma ed epitelio, forniscono probabilmente, anche la chiave di lettura per la comprensione dei meccanismi eziopatogenetici responsabili dell’ipertrofia prostatica benigna (IPB). Infatti McNeal [15], in base ad una serie di osservazioni morfologiche, ha ipotizzato che l’IPB sia causata dal "reawakening" delle cellule stromali che inducono la gemmazione di acini epiteliali e la crescita duttale.

Abbiamo pertanto analizzato le interazioni stroma-epitelio nell’IPB indotte sia da specifici fattori diffusibili che dalla matrice extra-cellulare studiando:

• gli effetti che queste interazioni esplicano sulla crescita, sul ciclo cellulare, sulla morfologia e sul pathway differenziativo di ciascun tipo cellulare prostatico
• la presenza nei terreni di coltura di eventuali sostanze diffusibili ad attività regolatoria.

Per conseguire questi obiettivi le ricerche sono state articolate nelle seguenti linee sperimentali:

1. sviluppo di adeguati modelli sperimentali in vitro mediante isolamento e caratterizzazione di linee epiteliali e stromali prostatiche da tessuti ipertrofici, loro immortalizzazione mediante ingegneria genetica ed isolamento e caratterizzazione di linee cellulari provenienti da altri tessuti (testicolo, cute, tessuti cicatriziali esofagei, ecc.) da impiegare come controllo
2. studio degli effetti esercitati sulla crescita delle cellule prostatiche da DHT, EGF, bFGF, estrogeni e loro specifici inibitori (Suramina, Finasteride ecc)
3. analisi dei meccanismi induttivi stroma-epitelio in condizioni di co-coltura
4. produzione di surnatanti condizionati da cellule epiteliali e stromali e screening delle loro capacità induttive sulla crescita, il ciclo cellulare, la differenziazione e l’apoptosi delle cellule prostatiche
5. caratterizzazione ed isolamento dei fattori diffusibili ad attività regolatoria
6. analisi della crescita di cellule epiteliali su matrici extra cellulari.

Da 813 campioni bioptici di tessuto ipertrofico posti in coltura primaria tra il 1988 ed oggi [16, 17], sono state isolate 12 linee epiteliali stabilizzate e 8 linee stromali a vita definita. Altre due linee primarie, una epiteliale ed una stromale sono state immortalizzate mediante trasduzione con un vettore retrovirale MLV contenente il gene mutante T-Large Antigen di SV40 temperatura sensibile che permette loro di proliferare alla temperatura permissiva di 33°C e di entrare in fase stazionaria G1/G2 alla temperatura di 39°C. Tutte queste linee sono state caratterizzate dal punto di vista genotipico e fenotipico. Inoltre, sono state definite le loro richieste nutritive e sono state analizzate le loro capacità di crescita in terreni semisolidi. Una volta terminati questi studi, le linee sono state espanse e poste in banking mediante crioconservazione. Particolarmente impiegata nelle nostre ricerche, è stata la linea epiteliale U285 che è stata coltivata quasi ininterrottamente per 7 anni ed attualmente ha superato il 350° passaggio seriale in coltura. In queste cellule l’analisi degli effetti esercitati da DHT, EGF, finasteride e suramina sulla loro crescita ha evidenziato la presenza di fenomeni autocrini per il testosterone ed EGF confermati recentemente anche con tecniche di biologia molecolare [18-20]. Nelle co-colture di cellule epiteliali U285 con cellule stromali ingegnerizzate e non, la crescita cellulare risulta inferiore a quella attesa in base alle colture di controllo di sole cellule epiteliali e stromali. Inoltre, la valutazione a differenti end point delle percentuali di cellule stromali ed epiteliali presenti nelle co-colture ha evidenziato l’inibizione della crescita stromale. Questo fenomeno viene confermato dallo screening dei surnatanti condizionati. Infatti, la proliferazione delle cellule stromali prostatiche ingegnerizzate e non, viene fortemente ridotta dal surnatante condizionato dalle U285. Inoltre, questo surnatante induce apoptosi delle cellule stromali ingegnerizzate. Al contrario i surnatanti condizionati dalle cellule stromali stimolano la crescita delle cellule epiteliali U285. Fenomeni apoptotici si manifestano in co-coltura sia nelle cellule stromali che epiteliali U285. Se considerati globalmente, i risultati di queste sperimentazioni, in accordo con quanto ipotizzato da Tenniswood, indicano la presenza nel nostro modello sperimentale di un complesso meccanismo di regolazione della crescita cellulare in vitro. Le cellule di origine stromale producono uno o più fattori diffusibili capaci di stimolare la crescita delle cellule epiteliali U285. Queste, invece, rilasciano nel terreno di coltura uno o più fattori solubili che limitano la crescita delle cellule stromali inducendo in esse il fenomeno dell’apoptosi. Le cellule stromali in apoptosi a loro volta indurrebbero tale fenomeno nelle cellule stromali presumibilmente attraverso altri fattori induttivi. La ridotta crescita nelle co-colture sarebbe, pertanto, il risultato ultimo della sommatoria di questi contrastanti fenomeni. Attualmente stiamo lavorando all’isolamento del fattore epiteliale inibente nel tentativo di identificare la sua struttura. Un successivo passo sarà quello di verificare la sua produzione anche da parte dell’epitelio prostatico in vivo.